Религиозная полемика православной элиты с католиками развернулась после выхода в свет в 1577 году цитированной выше книги Петра Скарги. Новый импульс противостояния был вызван намерениями заменить юлианский календарь григорианским. Инициатором этого нововведения в 1582 году был римский папа Григорий XIII. Константинопольский патриарх, а вместе с ним православное большинство выступило категорически против. Король Стефан Баторий не смог притушить этот конфликт, и пламя религиозной дискуссии разгорелось.
Появление в Украине типографского искусства стало мощным фактором упрочнения позиций православия. Константин Острожский с единомышленниками в результате титанического труда подготовил к изданию на славянском языке знаменитое полное издание Библии. Между прочим одним из источников написания Острожской Библии был полный старославянский текст, найденный в Москве и привезенный от царя Ивана Грозного.
Конечно, Константин Острожский еще не мог поднимать вопросы политической независимости, поскольку был сыном своего времени и верным подданным польской Короны. Но его деятельность по защите православного вероисповедания создала надежные идеологические предпосылки для становления украинской политической элиты, которая через исторически короткое время выдвинет новые задачи на пути достижения государственной независимости Украины.
Просветительская деятельность князя Андрея Курбского. Князь Курбский из древнего рода князей ярославских был человеком необычайно образованным для своего времени. Сподвижник Ивана Грозного в воинских делах (завоевание Казани, Ливонские войны, взятие многих литовских городов), он был вынужден бежать в Литву, спасаясь от царской немилости. Польский король Сигизмунд Август наделил его многими поместьями. Просветительская деятельность князя Курбского проходила на Волыни. Созданный им в 1560 году кружок стал первым культурно-просветительским обществом в Украине, которое просуществовало около 15 лет. Сподвижники Курбского начали огромную работу над переводами богословских книг на славянский язык. За пятнадцать лет своего существования кружок князя Курбского проделал, по оценкам историков, титаническую работу, содействуя развитию богословия, налаживанию связей между различными православными центрами. Неоценимая заслуга Курбского состоит в написании патриотических произведений, предназначенных для чтения православными христианами, в возрождении антикатолической полемики.
Православные братства. Но не одни магнаты и духовные лица стали на защиту веры отцов. Возле православных храмов стали возникать так называемые братства, состоящие из представителей различных слоев населения. Братства оказывали православному духовенству посильную материальную помощь в отправлении религиозных обрядов. Это были небольшие группы (десятки верующих), которые со временем разрастались. Они создавали свои школы, выпускники которых были своего рода миссионерами греческо-русской веры в своем отечестве. Деятельность братств значительно усилилась после подписания Люблинской унии. Значительным событием в начале XVII века стало присоединение к киевскому братству запорожского казачества.
Берестейская уния. На фоне миссионерской деятельности иезуитов и протестантов, прошедших большую школу религиозно-догматических споров, православные священники выглядели просто невежами. При таких духовных наставниках, которые не умели объяснить элементарные христианские понятия и даже не знали церковно-славянского языка, простой народ только назывался христианским. Зародившаяся в украинской православной среде идея сближения с образованным католическим Римом, начала облекаться в ощутимые формы. Четыре епископа православного вероисповедания втайне от других иерархов в 1590 году начали переговоры по этому вопросу с представителями римской католической церкви и польского короля. В результате долгих дискуссий основные догматические религиозные расхождения были сведены к минимуму. Переговоры инициаторов объединения закончились в июне 1595 года решением подписать унию. Два инициатора унии епископы Кирилл Терлецкий и Ипатий Поцей выехали в конце 1595 года в Рим, где папа Клемент VIII провозгласил ее официальное признание. Однако, эта новость вызвала настоящую бурю среди православного люда в польском государстве. Князь Константин Острожский возглавил антиуниатское движение, результатом которого было гневное осуждение инициаторов унии по всей территории украинских земель. Протест был настолько мощным, что два епископа из числа инициаторов унии отреклись от своих взглядов и перешли на сторону оппозиции. Однако, польский король Сигизмунд III Ваза, будучи приверженцем католичества и сторонником унии, созвал в Бресте собор для утверждения унии. На церковный собор съехались украинские епископы, зарубежные православные иерархи, десятки выборных представителей знати и более 200 священников. Накал страстей на берестейском соборе можно ощутить из следующего эпизода. Подписанная уния была для Польской короны настолько значимым событием, что на Берестейский собор прибыл король Сигизмунд III Ваза. В разгар дискуссии по поводу обвинения представителя константинопольского патриарха Никифора король вошел в помещение, где находился Константин Острожский и другие сенаторы. Непримиримый защитник православия, будучи уже глубоким стариком, князь Острожский произнес обличительную речь в адрес короля: " ... Ваша королевская милость посягаете на право нашей веры, стесняете наши вольности, насилуете нашу совесть и сами нарушаете присягу свою. Я, сенатор, не только терплю оскорбление, но вижу, что дело идет к окончательной погибели всей Короны польской; после этого уже никто не обеспечен в своем праве и свободе... Опомнитесь, Ваше величество, и послушайте доброго совета! Я сильно оскорблен Вами, на старости лет у меня отнимают то, что для меня всего милее: совесть и православную веру".
Но напрасны были жаркие многодневные дискуссии, - дело решилось в пользу униатов. Несколько слов о смысловом содержании унии. Во-первых - признание верховенства папы римского в Церкви Христовой над всеми людьми греческого вероисповедания, как духовного, так и светского звания. Во вторых - признание григорианского календаря. В третьих - сохранение обрядности православной церкви. В четвертых - сохранение в обеих церквах обряда Святого Причастия: в католической - составная часть жертвы Пресвятой Евхаристии под одним видом (хлеб), в униатской и православной - под двумя видами (хлеб и вино). В пятых разрешение отправлять церковную службу духовным православным в римском костеле, а духовным католикам - в православном храме. В шестых - обеспечение представительства обоих церквей в польском сейме. Не удалось договориться по вопросу признания Святого Духа.