Остановимся на молекулярно-биологических методах диагностики, из числа которых сейчас наибольшего внимания заслуживает гибридизация. При прочих равных условиях, молекулярная гибридизация предпочтительнее других методов в следующих случаях:

— при изучении микроорганизмов, которые трудно культивировать (вирусы, возбудители лепры или туберкулёза, лептоспиры, микоплазмы и пр.) или которые быстро меняют антигенную структуру (возбудители гриппа и ящура, кампилобактер, нейссерии и др.);

— когда иммунитет носит преимущественно клеточный характер;

— при наличии в исследуемых объектах нежизнеспособных бактерий данного вида, даже в присутствии посторонних микроорганизмов;

— если возникает необходимость быстро дать ответ о лекарственной резистентности;

— когда надо решить вопрос, не прибегая к опытам in vivo, обладает ли штамм вирулентностью или токсигенностью.

Для диагностики возбудителя чумы предложены полинуклеотидные зонды, в частности относительно небольшой (900 пар оснований) фрагмент pPst [McDonough K. A. et al., 1988]. Было показано, что этот зонд пригоден для выявления чумного микроба у блох и в органах животных [Thomas et al., 1989]. С его же помощью K. A. McDonough и S. Falkow [1989] смогли найти объяснение роли плазмокоагулазы и фибринолизина в экологии чумного микроба. Сходный зонд (pLD625) получен также мною совместно с А. Л. Мельниковым [а. с. СССР, № 284593 от 11.10.88, с приоритетом от 27.10.87]. Поскольку оба зонда получены из pPst, присущей только чумному микробу, они обладают высокой специфичностью.

Относительно недавно сконструирован также олигонуклеотидный зонд [Kapperud G. et al., 1990]. Это стало возможным после расшифровки нуклеотидной последовательности гена вирулентности yopA на pCad [Forsberg A. et al., 1987; Skurnik M. и Wolf-Watz H., 1989]. В отличие от зонда на основе pPst этот зонд обладает групповой специфичностью (выявляет вирулентные штаммы Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Тем не менее в сочетании с зондом на основе pPst олигонуклеотидный зонд может помочь повысить эффективность поиска возбудителя чумы в природных очагах, особенно в межэпизоотический период.

До сих пор применению молекулярной гибридизации в полевой практике мешает необходимость маркировки зондов радионуклидами [Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1992] и связанная с этим трудность регистрации результатов. Поэтому мы разработали другой метод маркировки зондов, включая олигонуклеотидные. Принцип его заключается в гаптенизации азотистых оснований в составе зондов, получении к ним специфических антител и регистрации результатов, как при ИФА. Этот принцип не нов, но в сочетании с некоторыми особенностями его реализации он приобрел определенную оригинальность, позволяющую рассчитывать на возможность его широкого применения [а. с. СССР, № 1637336 от 3.05.89 и № 1659487 от 2512.88].

В последнее время в практику исследований на чуму начинают внедрять полимеразную цепную реакцию (ПЦР), которая лишена многих недостатков, присущих гибридизации, и позволяет в течение нескольких часов определить единичные клетки возбудителя.

В заключение упомянем еще об одном ускоренном методе выявления чумного микроба, обладающем большой разрешающей способностью. Мы имеем в виду реакцию нарастания титра фага [Домарадский И. В. и др., 1957]. Принцип метода основан на том, что титр индикаторного фага резко, на несколько порядков, возрастает в присутствии живых бактерий (его хозяев, и не изменяется в контрольных пробах, где этих бактерий нет. К недостаткам метода можно отнести необходимость титрования фага по методу Грация, однако сейчас предложены модификации метода, которые лишены этого недостатка, хотя и нуждаются еще в доработках [Апарин Г. П., Голубинский Е. П., 1989; Голубинский Е. П. и др., 1992].

5. Иммунитет

5.1. Гомологичный иммунитет

Несмотря на большие успехи в борьбе с чумой, связанные с внедрением антибиотиков, улучшением контроля за носителями и переносчиками чумного микроба в природных очагах, нет уверенности в том, что эпидемии чумы не будут повторяться. Проблема специфической профилактики поэтому по-прежнему актуальна, однако для полного решения её еще далеко. Как и раньше [Николаев Н. И., 1968; Комитет экспертов ВОЗ по чуме, 1971], нет единого мнения о преимуществах тех или иных вакцин, методах учёта эффективности прививок, показаниях к ним и даже о способах проведения иммунизации.

Имеется по крайней мере три вопроса, без ответа на которые проблему специфической профилактики полностью решить нельзя. Один из них относится к механизму иммунитета против чумы, второй касается антигенной структуры чумного микроба, поскольку до сих пор нет ясности, какой из многочисленных антигенов имеет решающее значение для защиты. И, наконец, третий вопрос, на первый взгляд несерьезный, а на самом деле принципиальный, связан с выбором адекватной модели для изучения иммунитета к чуме. Все эти вопросы неотделимы друг от друга и трудности получения ответа на них усугубляются тем, что естественной резистентности человека к чуме нет. Недаром П. Ф. Здродовский [1963} относил её к числу инфекций, при которых «встреча с возбудителем практически равнозначна заболеванию». Учитывая сказанное, выделение возбудителя из носоглотки внешне здоровых людей [Падлевский Е. В., 1915; Wu Lien-Teh et al., 1936} надо трактовать не как «естественную резистентность» к чуме, а как «бессимптомное заболевание» [Marshall J. D. et al., 1967] или реинфицирование [Pollitzer R., 1954]. Тот факт, что последнее действительно может иметь место, относительно недавно получило новое подтверждение. Речь идёт о двух лицах, заболевших чумой повторно, до этого (за 4 года и 6 лет соответственно) чума у них была подтверждена бактериологически [Butler T., Hudson B. W., 1977]

Ууместно напомнить, что в отличие от человека естественная устойчивость к чуме присуща птицам, земноводным, рептилиям и даже многим млекопитающим [Попов П. П., 1915; Федоров В. Н., др., 1955; Ралль Ю. М., 1965; Pollitzer R., 1954]. Однако причины её пока не вскрыты и поэтому для понимания сущности иммунитета человека к чуме этот факт пока ничего не дал. Впрочем, луч света на это могут бросить относительно новые данные о взаимодействии ЛПС с клеточными элементами иммунной системы разных видов млекопитающих, земноводных (лягушек) и птиц (цыплят). Так, J. Roeder и соавт.[1989], показали наличие у В-лимфоцитов и лейкоцитов млекопитающих ЛПС-связывающего белка с молекулярной массой 80 кДа, которого нет у мононуклеарных клеток животных, нечувствительных к ЛПС. Несколько ранее Zh. M. Isin и B. M. Suleimenov [1987] установили, что между «антимикробным потенциалом» лейкоцитов — кислородзависимым метаболизмом и активностью миелопероксидазы (и чувствительностью к чуме различных видов животных существует определенная связь.

Говоря о восприимчивости к чуме, надо упомянуть о существовании определенной корреляции её с ABC-системой крови человека, на что обратил внимание G. Jorgensen [1981].

Н. Н. Жуков-Вережников и Т. Д. Фаддеева [1937] были, по-видимому, первыми, кто установил, что фагоцитоз чумного микроба in vitro резко усиливается в присутствии сывороток животных, иммунных к чуме. Последующие опыты E. Jawetz и K. Meyer [1944] подтвердили это. Теперь уже твердо установлено, что по мере развития иммунитета фагоцитоз чумного микроба приобретает завершённый характер В то же время протективные свойства специфических антител сами по себе выражены очень слабо, о чём свидетельствуют неутешительные результаты бесчисленных попыток серопрофилактики и серотерапии [Жуков-Вережников Н. Н., 1940; Wu Lien-Teh et al., 1936; Pollitzer R., 1954], а также отсутствие влияния циклофосфана на уровень приобретенного иммунитета у лабораторных и диких грызунов [Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1992] Следовательно, как уже указывалось, в иммунитете к чуме основная роль принадлежит не гуморальным, а клеточным факторам (Т-лимфоцитам и связанной с ними гиперчувствительности замедленного типа, которая давно уже рассматривается как показатель специфичности и напряженности иммунитета против чумы. Подтверждением роли клеточных факторов служат, в частности, данные об адоптивном иммунитете при переносе лимфоидных клеток, иммунодепрессирующем эффекте антилимфоцитарных и антимоноцитарных сывороток на иммунизированных морских свинках и повышении в процессе иммуногенеза в крови числа Т-хелперов и в меньшей степени Т-супрессоров [Васильева Г. И., 1990; Исупов И. В. и др., 1990; Назарова Л. С. и др.,1990; Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1992].