После болезни Прохор с усердием продолжил учение. Он быстро постигал церковную грамоту, ежедневно читал Священное Писание, духовно-назидательные книги, обнаруживая при этом светлый ум и ясную память, украшая себя кротостью и смирением.

Со временем Прохора начали обучать торговому делу, которым занимался его брат Алексей. Работа эта не привлекала отрока, и он выполнял поручения, исключительно повинуясь старшим.

Более всего Прохор возлюбил постоянное пребывание в храме, сердечную молитву и непрестанное размышление о Боге, предпочитая суете мира уединение и безмолвие. Возрастало его стремление к иноческой жизни.

Прежде чем принять постриг, Прохор вместе с пятью сверстниками, из которых четверо по его примеру посвятили жизнь служению Богу, отправился в Киев на поклонение святым угодникам Печерским и за наставлениями к старцам.

Прозорливый старец-затворник Досифей, которого посетил Прохор, одобрил намерение юноши принять иночество и указал на Саровскую пустынь как место его спасения и подвигов: «Гряди, чадо Божие, и пребуди тамо. Место сие будет тебе во спасение. С помощью Божией там окончишь ты и свое земное странствование. Святой Дух, сокровище всех благих, управит жизнь твою во святыне». Интересно, что именем Досифей назвалась живущая в затворе в Китаевской обители старица, которую в миру звали Дарья Тяпкина. Она была известна еще при жизни бескорыстным служением.

20 ноября 1778 года, накануне праздника Введения во храм Пресвятой Богородицы, Прохор прибыл в Саровскую обитель, где с любовью был принят как послушник ее настоятелем. Подражая старцам, он раньше других приходил в храм, неподвижно, с закрытыми глазами выстаивал богослужение до конца и уходил последним, жалея, что человек не может беспрерывно, подобно ангелам, служить Богу.

Находясь на келейном послушании, Прохор со смирением выполнял и другие монастырские работы: пек хлеб, делал просвирки, столярничал. Никогда он не бывал праздным, но постоянной работой старался оградить себя от скуки, считая ее одним из «…опаснейших искушений для новоначальных иноков, которое врачуется молитвой, воздержанием от празднословия, посильным рукоделием, чтением слова Божия и терпением, потому что рождается оно от малодушия, беспечности и празднословия».

По примеру некоторых монахов пустыни Прохор, испросив благословения у своего наставника, в свободные часы уходит в лес для уединения, Иисусовой молитвы и духовных размышлений. Его подвижничество обратило на себя внимание братии и снискало отеческую любовь старцев. Так, во время тяжелой болезни Прохора они неотлучно находились при нем, заботясь о его выздоровлении.

Почти три года безропотно выносил он сильные страдания, отклонив врачебную помощь. Когда состояние Прохора значительно ухудшилось, о его здравии были отслужены всенощное бдение и божественная литургия. Именно в это время его посетило чудесное видение Пресвятой Богородицы в сопровождении апостолов Петра и Иоанна Богослова. Возложив на голову больного руку, Она даровала ему выздоровление, сказав: «Сей — от рода Нашего».

На месте явления Пречистой Девы Марии был сооружен больничный храм. Сбор пожертвований на его строительство как новое послушание взял на себя Прохор. Он же изготовил престол из кипарисового дерева для одного из приделов — преподобных Зосимы и Савватия Соловецких, чудотворцев, в котором в память о великой милости Божией к нему положил за правило причащаться святых Христовых тайн до конца дней своих.

18 августа 1786 года Прохор был пострижен настоятелем обители иеромонахом Пахомием в монашество с именем Серафим, а спустя год посвящен в иеродиакона епископом Владимирским и Муромским Виктором. В продолжение шести лет он ежедневно совершал богослужения, проводя в храме все время, свободное от монастырских послушаний.

Небесные видения часто посещали его. Неоднократно созерцал преподобный святых ангелов, Иисуса Христа в окружении небесных бесплотных сил. Видения эти усилили ревность подвижника к отшельничеству: днем он трудился в обители, а вечером удалялся в лес, где в пустынной келье ночью предавался молитве и богомыслию.

2 сентября 1793 года по ходатайству старцев преподобный Серафим был рукоположен в иеромонахи. Тот, кто благоговейно приобщается святых Христовых тайн (а приступать к причащению, по словам преподобного Серафима, чем чаще, тем лучше), тот «будет спасен, благополучен и на самой земле долговечен». Наставляя других, старец сам неизменно следовал этому правилу всю жизнь.

20 ноября 1794 года, в годовщину своего прибытия в Саровскую обитель, преподобный испрашивает благословения на новый подвиг — пустынножительство и поселяется в глухом лесу в нескольких километрах от монастыря. По благочестивому обычаю он дает разным местам вокруг своей деревянной избушки названия в память о событиях земной жизни Спасителя: Вифлеемская пещера, град Иерусалим, река Иордан, поток Кедрон, Голгофа…

В «дальней пустыньке», как любил называть свое уединенное жилище святой старец, он ежедневно совершал молитвенное правило по строгому уставу древних пустынножительных обителей, а также по чинопоследованию, им самим составленному и известному как «келейное правило отца Серафима», нередко полагая при этом до 1000 поклонов.

Кроме молитв нужно было заботиться о хлебе насущном. Старец рубил дрова в лесу, заготавливал на болоте мох, работал на пчельнике и возделывал огород, устроенный близ кельи, наизусть воспевая церковные песнопения.

Одеждой преподобному служил один и тот же белый полотняный балахон; носил он также старую камилавку и лапти, а в ненастную погоду — подрясник из черного толстого сукна да кожаные полумантию и чулки-бахилы. Образ жизни старца был до крайности суров, даже в сильные морозы его келья не отапливалась. Спал он на полу, прислонившись спиной к стене либо положив под голову камень или поленья, и делал это «ради умерщвления страстей».

Сам добывая себе пропитание, преподобный соблюдал очень строгий пост, питаясь один раз в сутки преимущественно овощами да черствым хлебом, небольшими запасами которого он делился с птицами и дикими животными. Не раз видели, как старец из рук кормил огромного медведя, служившего ему. Он не принимал пищу в среду и пятницу, часто во время поста голодал. Со временем Серафим отказался от помощи со стороны обители, усилил воздержание и пост, питаясь около трех лет лишь травой снытью, которую сам сушил, заготавливая на зиму.

Стремясь к безмолвию, старец оградил себя от посетителей, однако иноков, желавших уединения, принимал ласково, не отказывая в наставлениях, но благословение на такой подвиг старался не давать, зная, что такая аскетическая жизнь не под силу многим. Его же духовная сила прибывала благодаря строгости и молитвам.

Подвижник взял на себя особый подвиг — столпничество. Каждый вечер на закате преподобный поднимался на большой гранитный камень, лежавший в лесу на полпути от обители к его келье, и до рассвета с воздетыми к небу руками молился. С наступлением утра он возвращался в келью и в ней, чтобы уровнять ночные подвиги с дневными, вставал на другой, малый, камень, принесенный из леса, и оставлял молитву лишь для краткого отдыха и подкрепления тела скудной пищей.

Тысячу дней и ночей, несмотря на мороз, дождь, зной и стужу, продолжал он это молитвенное стояние. Однажды на его келью набрели разбойники, которые, угрожая расправой, стали требовать у него денег. По их разумению, к старцу ехали люди, часто богатые, и у него должны были быть деньги. Не встретив сопротивления, они жестоко избили подвижника, проломили ему голову и сломали несколько ребер, а затем, все сокрушив в келье и ничего не найдя, кроме иконы и нескольких картофелин, бежали, устыдившись своего злодеяния.

Утром преподобный с трудом добрел до обители. Восемь суток страдал он от нестерпимой боли, отказавшись от помощи врачей, вызванных настоятелем, предоставив свою жизнь воле Господа и Пречистой Его Матери. И когда надежда на выздоровление, казалось, исчезла, Пресвятая Богородица явилась старцу в тонком сне в сопровождении апостолов Петра и Иоанна Богослова и даровала ему исцеление. В тот же день преподобный встал с постели и еще пять месяцев пробыл в монастыре до полного выздоровления. Старец остался навсегда согбенным и ходил, опираясь на топорик или на посох, однако обидчиков простил и просил не наказывать.