Казалось, с появлением иммуногистохимического метода проблема обнаружениягормонов в организме должна быть решена. И действительно, за время, прошедшеепосле 1941 года, когда Кунс впервые предложил метод, было открыто много местсинтеза гормонов и изучены разные стороны их обмена в живом организме. Однако,появились и свои ограничения, связанные, с одной стороны, с недостаточнойчувствительностью метода, а с другой - с потребностью изучения гормонов нетолько в клетках, но и в крови, доступной для массовых исследований в клиническойпрактике. Эти препятствия были преодолены с разработкой радиоиммунологическогометода определения гормонов.

Суть метода, автором которого является американский радиохимик из госпиталяв Бронске (Нью-Йорк) Р. Ялоу, заключается в том, что антисыворотка к гормону впроцессе ее приготовления метится дополнительно еще и радиоактивным изотопом,чаще всего йодом-125. При смешивании антисыворотки с исследуемой кровьючеловека или животного антитела взаимодействуют с содержащимся в кровигормоном. По уровню радиоактивности, излучаемой изотопом, соединившимся сопределенным гормоном, определяется количество этого вещества. Чувствительностьданного метода очень высока: он способен зарегистрировать количества гормона,измеряемые в десятых долях нанограмма.

Радиоиммунологический метод нашел широкое применение в медицине,животноводстве, других отраслях биологии. С его развитием появилась возможностьследить за изменением уровня и скорости синтеза, секреции и метаболизмагормонов, в нужных ситуациях активно регулировать функцию гормональной системы.За разработку, широкое внедрение радиоиммунологического метода и изучение с егопомощью синтеза и метаболизма пептидных гормонов Розалин Ялоу в 1977 году былаудостоена Нобелевской премии.

После фундаментальных работ Ялоу многие химические фирмы приступили кмассовому выпуску специальных коммерческих наборов реактивов для определениягормонов. В Советском Союзе выпускаются, например, наборы для определенияинсулина, некоторых гормонов гипофиза. Производственные базы для этого созданыв Минске и Риге в соответствующих химических институтах республиканскихакадемий наук. Широкое распространение таких наборов привело к резкойинтенсификации исследований эндокринной системы как в научном, так и вприкладном плане. Во многих клиниках открылись специальныерадиоиммунологические лаборатории. Однако в процессе развития метода сталипоявляться серьезные препятствия для его широкого внедрения. Во-первых,необходимо довольно большое количество антигенов, то есть гормонов для иммунизации,и соответственно большое число животных. Были открыты специальные заводы поискусственному синтезу гормонов (здесь тоже есть свое ограничение - не всегормоны можно искусственно синтезировать, да еще в больших количествах) ифермы, на которых выращивались и содержались животные: кролики, морские свинки,обезьяны и овцы. Затраты на получение синтетических гормонов и содержаниеживотных обусловили высокую стоимость соответствующих наборов.

Вторая проблема относилась к самим антисывороткам. Дело в том, что приобработке вместе с антителами к определенным гормонам из крови животныхвыделялись, хоть и в небольших количествах, другие антитела, которые в рядеслучаев снижали специфичность антисывороток, реагируя не только с однимопределенным гормоном, но и с веществами, близкими к нему по антигеннойструктуре, например с белками. Да и видовые особенности антител в какой-то мерезатрудняли анализ.

Развитие науки требовало качественно нового подхода к решению проблемыполучения антител. Необходим был метод, позволяющий в искусственных условияхполучать большое количество антител строго заданной специфичности. И такойметод был разработан. Его создание связано с именами трех известныхиммунологов: Нильса Ерне, Цезаря Милстейна и Георга Келлера - нобелевскихлауреатов 1984 года.

Нильс Ерне заслуженно пользуется уважением в научном мире. 73-летний ученыйза всю свою жизнь работал во многих научных учреждениях разных стран, егоблестящие лекции слушали в Европе, Америке и Азии, в том числе и в СССР, кудаон приезжал несколько раз. Работы Ерне по механизмам образования антителявились теоретической почвой для последующих практических разработок Ц.Милстейном и Г. Келлером нового метода получения специфических антител.

Цезарь Милстейн с 1962 года занимается исследованием антител, происхождениемих разнообразия, генетическими основами их специфичности. В начале 70-х годовон стал изучать лимфоциты - клетки, продуцирующие антитела, как у здоровыхлюдей, так и у людей с опухолевым поражением крови. Эти работы привели его коткрытию так называемых "гибридных клеток", возникающих при слиянииразличных лимфоцитов. Неизвестно, как все сложилось бы, если б в это время влабораторию Милстейиа не приехал Г. Келлер…

Интерес Георга Келлера к разнообразию антител возник при выполнении имдокторской диссертации у Н. Ерне в Базеле. Для продолжения исследований Ернепосоветовал Келлеру поехать к Милстейну в Кембридж, Ни Келлер, обратившийся кМилстейну с просьбой о разрешении приехать, ни Милстейн, давший свое согласие,учитывая рекомендацию Ерне, ни сам Ерне не предполагали, что эти обстоятельстваприведут их через 10 лет к Нобелевской премии.

Приехав в 1974 году в Кембридж, 28-летний Келлер начал заниматься получениемгибридов разных миеломных (опухолевых) клеток мышей. Однако, быстро поняв, начто годен новый сотрудник, Милстейн буквально через несколько месяцев ставитему более сложную, но вполне определенную задачу - получить такие гибридныеклетки, которые бы синтезировали антитела с любой заданной специфичностью. ИКеллер блестяще справляется с этим. В конце 1974 года он вместе со своим шефомпроводит опыты по слиянию миеломных клеток, способных длительно расти вкультуре ткани с лимфоцитами мышей, образующими антитела, но неспособными кдлительному росту вне организма. Эти эксперименты принесли желаемые результаты,гибридные клетки продуцировали антитела. В августе 1975 года появилась нынезнаменитая статья Г. Келлера и Ц. Милстейна, в которой описывалась техникаполучения гибридом.

Огромное преимущество гибридомной техники заключается в том, что дляполучения антител не нужно большого количества антигена. Достаточно один разпроиммунизировать мышь, взять от нее кровь, выделить лимфоциты, продуцирующиеданные антитела, слить их с миеломными клетками, способными к быстрому росту,затем отобрать гибридную клетку, синтезирующую введенные антитела, размножитьее на питательной среде и клонировать (получать от нее потомство) сколь угоднодолго и в любом нужном количестве. В результате появляется возможностьнеограниченного получения гибридом, образующих лишь один-единственный вариантантител (то есть моноклональные антитела), что полностью снимает проблему ихспецифичности.

Это открытие за короткий срок оказало революционное влияние на различныеобласти биологии и медицины. Получение моиоклональных антител составляет сейчасважнейшую часть биотехнологического производства. Подсчитано, что в ближайшиегоды оборот фирм, участвующих в продайте моноклональных антител, достигнетмиллиарда долларов.

Моноклональные антитела являются строго специфическим реагентом - прекрасныммаркером химических веществ. С помощью моноклональных антител с каждым годомоткрываются все новые и новые активные вещества и места их синтеза. Отрывочныесведения о процессах, в которых участвуют гормоны, теперь можно дополнить исоздать самые настоящие досье, учитывающие перемещения молекул, оценивающиевзаимодействие их в различные периоды жизни и при разных заболеваниях. Получивметку - моноклональное антитело, гормон обнаруживает себя повсюду, находясьдаже в самых минимальных количествах.

Именно с помощью гибридомной техники, метода моноклональных антител ученыеустановили в последние годы многие неизвестные ранее закономерностигормональной регуляции. Были сделаны принципиально новые важные открытия впознании механизмов различных заболеваний, поиске методов их диагностики илечения.