Между ее приближенными стали зарождаться гибельные замыслы об избавлении королевы от ненавистного мужа. Летингтон составил план столько же искусный, сколько и безнравственный. Этот план официально назывался «Дело о разводе королевы с мужем». О нем сообщили Босуэлу и другим придворным. Босуэл и королева охотно примкнули к нему. Но все знали, что испросить развод у папы нелегко, потому что для этого надо было сослаться на близость родства; не было также основания и начать с Дарнлеем процесс о нарушении супружеской верности или же обвинить его в измене. Мария видела эти затруднения. Но бесстыдный Летингтон попросил королеву предоставить это дело ему и ее друзьям. Организовалось тайное общество, члены которого подписали акт об убийстве короля как молодого сумасброда и тирана, врага дворянства и человека, державшего себя невыносимо по отношению к королеве. Бальфер, Гэнтли, Аджиль и Летингтон подписали его и сдали Босуэлу. Между тем состоялось крещение сына Марии Стюарт и Дарнлея. Королева Англии Елизавета, изъявив согласие быть восприемницей новорожденного, прислала вместо себя графиню Арджиль, а графу Бетворду поручила отвезти золотую купель. Хотя крещение было совершено по католическому обряду, но распоряжался им протестант Босуэл. Дарнлея даже не пригласили на церемонию.

Видя такое презрение к себе, а также с ужасом узнав о возвращении в отечество своих врагов Мортона, Рутвена и Линдсея и о полном прощении их королевой, Дарнлей немедленно уехал в Глазго к своему отцу графу Леноксу. Не успев приехать туда, он заболел оспой. Заговор против его жизни шел безостановочно. Босуэл приобретал все новых соучастников.

Спустя несколько недель после заболевания Дарнлея к нему в Глазго приехала сама королева. Это неожиданное посещение удивило выздоравливающего. Стороною он случайно узнал о заговоре против него. Но усыпленный видимой нежной привязанностью Марии, Дарнлей снова подпал под влияние королевы. В глубине сердца Дарнлей всегда страстно любил ее, и причиной его удаления от двора были столько же мучения ревности, сколько и оскорбленное самолюбие. Когда Мария стала упрекать его за боязливость и подозрительность, выказав при этом больше ласки, чем отвращения, Дарнлей обнаружил перед ней глубокое раскаяние, приписав свои ошибки молодости и неопытности, и обещал не впадать в них более. Он выразил ей, какое удовольствие он испытывает, видя ее около себя, и умолял не покидать его снова. Королева предложила ему переехать в Крэгмилар. Дарнлей обещал это, если она будет жить с ним в супружеском согласии. Она согласилась, но потребовала, чтобы он сохранил это примирение в тайне. После этого, нежно пожав его руку, она уехала.

Такое примирение королевы с Дарнлеем, разумеется, не было искренним. Ослепленная страстью и подчинявшаяся зверским и честолюбивым намерениям своего любовника, Мария отправилась в Глазго с целью коварно овладеть доверием Дарнлея и, выказав ему лицемерное участие, привлечь в Эдинбург и здесь предать в руки его врагов. Подобное вероломство кажется невероятным, но письмо к Босуэлу, однако, доказывает это. Она пишет: «Вы принуждаете меня до такой степени притворяться, что я прихожу в ужас; мало того, вы заставляете меня играть роль предательницы; не забудьте, что если бы не желание угодить вам, то я скорее бы решилась на смерть, чем на подобные поступки… Он хочет ехать со мной не иначе как с условием разделить со мной по-прежнему стол и ложе… если я соглашусь на это, то он сделает все, что мне угодно, и последует за мной».

Чтобы достигнуть брака с Босуэлом, Мария Стюарт не побоялась пожертвовать своею честью, обременить свою совесть, подвергнуть опасности свою особу, заглушить в себе голос сострадания и пожертвовать отцом своего сына. «Да простит мне Бог», — говорила она потом, терзаемая угрызениями совести. Вскоре королева перевезла Дарнлея, по совету Босуэла, не в Крэгмилар, а в Керк-оф-Фильд. Несмотря на предупредительность королевы, Дарнлея не покидали подозрения. Все еще слабого от болезни короля поместили в двухэтажном доме Бальфера. Он занял первый этаж, королева же велела поставить свою кровать в комнате, находившейся под спальнею короля. Устроившись таким образом, хотя и неудобно, возле Дарнлея, королева провела несколько ночей под одной с ним кровлей. Босуэл между тем заботился о приготовлениях к убийству. Чтобы обеспечить себе безнаказанность, он подыскал второстепенных помощников. Орудиями его замысла стали: его лакей, портной, привратник, его брат и два головореза из бывших солдат. Босуэл заказал поддельные ключи ко всем дверям дома Бальфера и привез бочонок пороху, который решено было поставить в комнату королевы и поджечь, взорвав дом.

В вечер на воскресенье 9 февраля королева приказала вынести свою новую бархатную постель, находящуюся в комнате короля, и заменить ее старою. Из ее собственной комнаты она приказала вынести богатое кунье одеяло, которое, без сомнения, она не хотела оставлять перед взрывом. Вечер воскресный она провела с королем, уверяя его, что останется ночевать в доме Бальфера. Пока она дружески разговаривала с Дарнлеем, внизу делались приготовления к убийству. Босуэл распределил все роли между соучастниками. В 10 часов вечера, когда все было готово, королева вспомнила, что она должна быть во дворце на свадьбе свой любимой фрейлины. Простившись с королем, она в сопровождении Босуэла и свиты при свете факелов вышла. Дарнлей с печалью и невольным страхом смотрел на ее удаление. Этот несчастный, инстинктивно предугадывая смертельную опасность, искал утешения в Библии, громко читая псалмы. После этого он заснул, положив недалеко от себя в своей комнате пажа Тэйлора.

Между тем Босуэл, пробыв несколько времени на балу, в полночь возвратился. В сопровождении своих соучастников он через сад прошел к дому Бальфера. Двое часовых, узнав его, пропустили их. Обстоятельства заставляют думать, что двое убийц с помощью поддельных ключей проникли в комнату короля. Услыхав шум, Дарнлей набросил на себя шубу и соскочил с кровати, чтобы спастись бегством. Но убийцы схватили его и задушили. Таким же образом был убит и молодой его паж. Потом они перенесли трупы в маленький фруктовый сад, находившийся по соседству, где они и были найдены на следующее утро. Король был в одной рубашке, а шуба лежала возле него. Окончив это преступное дело, один из заговорщиков зажег фитиль, проведенный в бочку пороха, чтобы, взорвав дом, вернее скрыть следы убийства. Босуэл и другие злодеи отошли тогда на некоторое расстояние, дожидаясь взрыва, происшедшего в третьем часу утра. Услышав страшный треск, все бросились бегом в Эдинбург.

Войдя в свой кабинет, Босуэл в сильном волнении бросился в постель. Вскоре дежурный чиновник постучал к нему и взволнованно доложил: «Дом короля взлетел на воздух, и король убит». Услышав эту весть, Босуэл притворно выказал свое сильное негодование и вскричал: «Измена!» Он оделся и направился с пришедшим графом Гэнтли к королеве. Мария Стюарт, узнав ужасную новость, казалось, впала в безмолвное уныние. Она не обнаружила ни гнева, ни решимости против злодеев, лишь заперлась в своей комнате, сносясь беспрестанно только с одним Босуэлом. Затем тот в сопровождении отряда солдат отправился на место преступления. Жители Эдинбурга, пробужденные взрывом, собрались там уже с самой зари. Они рассеялись вокруг разрушенного дома и по саду, где лежали трупы. Босуэл приказал перенести тела жертв в соседний дом, не позволяя никому приближаться к ним и рассматривать их. Но уже все заметили, что на теле короля не было видимых ран, что он не был ни Обожжен порохом, ни убит падением; что шуба около него не была прожжена и что оба трупа не могли быть выброшенными на такое значительное расстояние без всякого повреждения. Через несколько дней Дарнлей был тайно погребен в Гомрудской капелле.

Как бы сраженная горем, королева Мария поручила тайному совету (состоявшему из соучастников убийства), секретарем которого был Летингтон, уведомить об этом несчастии французский двор.