1 июня 1847 года Гельмгольц был переведен в королевский полк Gardes-du-Corps, находившийся также в Потсдаме. Гельмгольц познакомился с семейством Фельтон, глава которого был военным врачом. Молодая Ольга фон Фельтон, с которой Гельмгольц часто играл на рояле, читал стихи и участвовал в спектаклях, произвела на него неизгладимое впечатление, и 11 марта 1847 года он был с ней обручен. 30 сентября 1848 года, прослужив 6 лет военным врачом, Гельмгольц был произведен в старшие врачи. Александр Гумбольт помог Гельмгольцу освободиться от оставшихся трех лет обязательной службы и содействовал его назначению на место Брюкке в Академию художеств и анатомо-зоологический музей. Академия и Мюллер были этим очень довольны. Но едва лишь Гельмгольц освоился в новых условиях, как уже в следующем году его ожидало новое назначение.
Профессора Брюкке перевели на кафедру физиологии в Кёнигсбергский университет, и ему потребовался заместитель. Это мог быть или опытный Дюбуа-Реймон, или Гельмгольц. Но так как Дюбуа-Реймона, пока он занимался научной работой, отец еще мог содержать, то выбор пал на его друга — Гельмгольца. По рекомендации Мюллера Гельмгольца приглашают в 1849 году профессором физиологии в университет Кёнигсберга. В Кёнигсберге в процессе своих исследований он сконструировал ряд оригинальных измерительных приборов. Большое распространение в разнообразных областях физиологического исследования и медицины получили сконструированные им глазное зеркало (офтальмоскоп), который дал возможность наблюдать глазное дно, и так называемый маятник Гельмгольца, позволяющий подвергать ткань быстро следующим друг за другом раздражениям с точной дозировкой времени. И в настоящее время офтальмоскоп играет огромную роль при диагностике не только глазных болезней, но и нервных заболеваний, таких как опухоли мозга, сухотка спинного мозга и т. д.
Кёнигсбергский период научной деятельности Гельмгольца был наиболее продуктивным. Там же он развил физиологическую теорию слуха, по которой в основе способности животных и человека различать один звуковой тон от другого лежит явление резонанса. Звук определенной высоты приводит в колебательное движение не всю основную звуковую мембрану, а только какую-нибудь одну группу ее волокон, резонирующих на данную звуковую частоту. На основе физических законов резонанса Гельмгольцем создано учение о слуховой функции кортиева органа, находящегося во внутреннем ухе человека.
Труды Гельмгольца в области физиологии посвящены изучению нервной и мышечной систем. Он обнаружил и измерил теплообразование в мышце термоэлектрическим методом (1845–1847) и, пользуясь им же разработанной графической методикой, детально изучил процесс мышечного сокращения (1850–1854) в опытах на лягушке; гальванометрическое измерение малых интервалов времени (по баллистическому принципу). Тогда Гельмгольц задался этой целью, его учитель, Мюллер, засомневался в возможности измерить скорость прохождения возбуждения по нерву, то почти неизмеримо малое количество времени, когда человек почувствовал боль от ожога. За этот ничтожный промежуток времени возбуждение должно проделать известный путь по нервным проводникам. Как же измерить скорость передвижения возбуждений по нервам? Да и возможно ли это? Будучи искуснейшим из экспериментов, Гельмгольц взялся за разрешение этой задачи, предложив гениальное по простоте решение.
Он подводил электрический ток к нерву лягушки у какой-либо ее мышцы. Ток возбуждал нерв, мышца отвечала на это раздражение сокращением. Затем он раздражал электрическим током тот же нерв не у самой мышцы, а на некотором расстоянии от нее. Мышца снова сокращалась, но несколько позднее, чем в первый раз. Эта разность во времени, разделенная на длину участка нерва между двумя точками, где прикладывалось электричество, показывала скорость, с которой раздражение прошло по нерву. У лягушки, на которой был проведен Гельмгольцем этот эксперимент, скорость распространения возбуждения по нервам оказалось равной 27 метрам в секунду. Как отличалась эта сравнительно небольшая скорость от той фантастической цифры, которую называли ученые! Предполагали, что скорость движения возбуждения по нервам равна скорости света — 300 тысяч километров в секунду!
В 1867–1870 годах совместно с русским ученым Н. Бакстом он измерил скорость распространения возбуждения в нервах у человека. Ряд исследований ученого относится к физиологии центральной нервной системы. Он впервые определил в 1854 году скрытый период рефлексов, сделал первую экспериментальную попытку определить ритмику импульсов, посылаемых мозгом к мышце (1864–1868), количественными методами определил скрытый период волевой мышечной реакции на раздражение органов чувств.
Учение Гельмгольца о «бессознательном выводе» как операции построения образа, в которой участвует мышечное движение, наполнило эту категорию новым содержанием. Роль мышечного движения в порождении сенсорных продуктов раскрыта в учении И.М. Сеченова, от которого тянутся нити к современным воззрениям на механизм переработки сенсорной информации.
Крупные работы, принесшие Гельмгольцу большую известность и обратившие на себя внимание Парижской академии наук, побудили прусское министерство народного просвещения утвердить Гельмгольца в 1851 году ординарным профессором, что значительно улучшило его материальное положение. В августе 1853 года Гельмгольц, оставив жену с двумя детьми у родных, предпринял первое путешествие в Англию, где познакомился с Фарадеем.
В области физиологии зрения он разработал способы определения кривизны оптических поверхностей глаза, в 1853 году дал теорию аккомодации. Показал, что зрительная оценка величины и удаленности предметов основана на своеобразных мышечных ощущениях, возникающих при движении мышц глаза. Идея Гельмгольца о роли мышечного чувства в формировании восприятий была глубоко разработана в психофизиологических трудах И.М. Сеченова.
При разработке вопросов физиологии зрения Гельмгольцу постоянно помогала его жена, которая была для него другом и помощником; она переписывала его рукописи, ей первой он читал свои лекции. В 1854 году тихая, счастливая, уединенная жизнь была омрачена смертью его горячо любимой матери. В то же время туберкулез жены начал угрожать ее здоровью. Гельмгольц стал предпринимать меры, чтобы переселиться в другой город, где климат был мягче, и такая возможность ему представилась, когда освободилась кафедра физиологии и анатомии в Бонне. В 1855 году он получил назначение на кафедру анатомии и физиологии в Боннский университет, где проработал до 1858 года.
На офтальмологическом конгрессе в Париже, где он в 1867 году прочитал доклад о чувстве рельефа, на торжественном обеде прозвучали слова: «Офтальмология была во мраке; — Бог сказал, что Гельмгольц родился, — и воссиял свет». В 1859–1866 годах Гельмгольц исследовал психологию и физиологию сенсорных процессов (зрительных, слуховых), цветоощущения. Он во всей полноте разработал учение о цветном зрении, исходя из предположения, что сетчатка имеет три основных цветоощущающих элемента. Развивая мысль о наличии в сетчатке глаза трех элементов, чувствительных к красному, зеленому и синему цвету, он разработал теорию возникновения цветовых зрительных ощущений. Красный, зеленый и фиолетовые цвета, по Гельмгольцу, являются первичными цветами, из оптического смешения которых возникает вся бесконечно богатая палитра красок, воспринимаемых человеческим глазом. Теория Гельмгольца выдержала испытание временем и в наши дни удовлетворительно объясняет физиологию цветных зрительных ощущений. Надо заметить, что работы по ощущению сложных цветов первым разрабатывал гениальный врач и физик Томас Юнг. Гельмгольц оставил человечеству свои замечательные исследования и по другим проблемам физиологии зрения.
В 1857 году баденское правительство предложило Гельмгольцу перейти на кафедру физиологии в знаменитый Гейдельбергский университет, где уже работали профессорами два его близких друга — Бунзен и Кирхгоф. Маленький Гейдельберг, один из городов герцогства Баденского. На холме — развалины старинного замка. Смотрят в воды Неккара кудрявые дубравы. Гейдельбергцы пышно именовали Дворцом природы скромное двухэтажное здание, в котором размещалась лаборатория Гельмгольца. В этой лаборатории Иван Михайлович Сеченов учился у Гельмгольца. Насколько велико было впечатление, произведенное на него учителем, можно судить по следующим его словам: