Морфология, физиология и генетика паразита и его взаимоотношения с растением-хозяином
Изучение физиологических особенностей паразита и внутривидового морфологического разнообразия дает ключ к правильному его определению, что интересно как для теории, так и для практики.
Морфологическая и физиологическая изменчивость наблюдается как в природе, так и в условиях чистой культуры. Проявляется она чаще и нагляднее всего в разнообразии размеров и форм спор, но может проявиться и рядом других признаков.
Изучение гриба методом чистых культур. Исследование гриба в условиях чистой культуры приходится проводить для детального изучения какой-либо одной или нескольких особенностей организма, так как в стандартных условиях культивирования любой признак проявляется особенно четко. В естественных условиях из-за различий в условиях произрастания или взаимодействия с другими организмами признаки могут затушевываться.
Чистая культура гриба — возбудителя парши яблони — была впервые получена Адерхольдом (R. Aderhold, 1896) на желатинизированных вытяжках из листьев и побегов яблони, груши, вишни, березы и свежих тыквенных растений.
Культуральные особенности гриба, выращенного из конидий или из сумкоспор, как указывает ряд авторов, бывают обычно почти одинаковыми.
Автором изучалось поведение штаммов гриба различного географического происхождения: северо-западный штамм-популяция (Ленинград), волжский (Саратов), украинский (Полтава), азербайджанский (Баку), московский (Москва), дальневосточный штамм-популяция (Хабаровск) и его моноспоровые изоляты, сахалинский штамм-популяция (о. Сахалин) и его моноспоровые изоляты.
На основании наблюдений за развитием гриба перечисленных штаммов на различных питательных средах (естественные: кусочки моркови и яблок в стерилизованном виде; искусственные: чистый агар, картофельный агар, картофельно-глюкозный агар, овсяный агар, яблочный агар, среда Чапека + агар, среда Чапека + агар с добавлением дрожжевого автолизата) мы пришли к заключению, что в качестве стандартной среды, дающей возможность подметить особенности развития гриба в чистой культуре, должна быть принята среда Чапека + агар, так как гриб на этой среде растет хорошо, но в то же время не настолько быстро, чтобы его особенности ускользали от внимания.
При изучении культуральных свойств вышеуказанных штаммов на среде Чапека выявлено 4 основных типа мицелия:
1-й тип — «мышь» — мицелий гриба тонкий, плотный, серый, вид колонии ровный, пушистый, напоминающий мех мыши
2-й тип — мицелий гриба, его гифы более толстые, жесткие, игловидные, светло-серые
3-й тип — колонии гриба пористые, ноздреватые, светло-серого цвета
4-й тип — колонии не плотные и не ровные, не пушистые, а как бы лизирующие, светлые
Наличие столь различных внешних признаков культуры гриба на единой среде говорит о большой неоднородности каждой популяции.
С целью выявления и сохранения однородных морфологических признаков гриба из одного типа мицелия каждой популяции были сделаны моноспоровые выделения штаммов. Таким образом выщеплялся клон из популяции, внешние культуральные признаки которого закреплялись путем отбора. При посеве таких, уже сравнимых между собой моноспоровых клонов на различные питательные среды снова проявлялась их внутренняя дифференциация, которая выражалась в изменении цвета колонии, пигментации субстрата и скорости роста мицелия.
Влияние температуры на развитие гриба. Для установления оптимальных условий развития гриба изучалось влияние различных температур на рост мицелия, пигментацию и образование конидий.
Все штаммы лучше росли при температуре 22°С. Однако здесь наблюдаются различные скорости роста мицелия и в образовании конидий. Штаммы волжский, украинский, дальневосточный и сахалинский намного опережают в росте другие. Особенно отчетливо различия штаммов выявились при анализе развития их в условиях крайних температур (12 и 32СС).
При 32°С штаммы из азиатской части СССР (дальневосточный и сахалинский) не растут, а штаммы из европейской части СССР обнаруживают слабый рост. Наоборот, при 12°С дальневосточный и сахалинский штаммы хорошо развиваются, намного опережая в росте европейские штаммы.
При наиболее благоприятной температуре (22°С) визуально заметный вегетативный рост начинается на третий день, а спороношение — на пятый. При температурах 12 и 32°С наблюдается заметное ограничение роста и спороношения гриба.
То обстоятельство, что все штаммы отличаются между собой по отношению к температуре, скорости роста и образованию спор, позволяет установить явление физиологической дифференциации вида на систему экологических или географических рас.
Изучая моноспоровые штаммы наших популяций, мы также пришли к выводу об их неоднородности. Здесь мы также сталкиваемся с разнообразием в потомстве одной клетки.
При высеве на полные и минимальные среды выявлена значительная внутривидовая и внутрипопуляционная изменчивость V. inaequalis по скорости роста. Это указывало на существование у данного гриба в природных условиях частичных биохимических (ауксотрофных) мутантов, так как обычно ауксотрофные мутанты получаются индуцированным путем. На первом этапе были выделены ауксотрофные штаммы, рост которых можно ускорить добавлением дрожжевого автолизата. Далее потребность штамма в определенных питательных веществах уточняли ауксонографическим методом Бейеринка в модификации Понтекорво (1949). Дальневосточный штамм МКДВ-50 реагировал на внесение смеси аминокислот «Б», МКДВ-10 — на аминокислоты группы «А», МКДВ-44 реагировал на смесь витаминов. Затем описанным методом моноспоровый штамм МКДВ-44 был идентифицирован как нуждающийся в витамине B1 (тиамине). Многократные пересевы подтвердили наследственный характер признака тиаминнедостаточности штамма МКДВ-44.
Полученные результаты подтверждают наличие внутривидовой изменчивости у гриба V. inaequalis и указывают на существование ауксотрофных мутантов в природе.
На основании экспериментальных данных Клейном (D. M. Kline и др., 1964) был сделан вывод о существовании корреляции между ауксотрофностью и потерей патогенности.
Размер спор у различных географических образцов. Изучение изменчивости можно продолжить и путем изучения наиболее просто учитываемого признака — размера спор.
Этот признак можно рассматривать как один из критериев вида или внутривидовых популяций.
Поскольку размер клетки — возрастной признак, к тому же варьирующий в зависимости от условий развития, то его нельзя выразить одним числом. Обычно указываются крайние из встреченных значений — пределы варьирования. Из статистики следует, что пределы являются непостоянным показателем, ибо крайние значения признака реже встречаются, больше шансов их пропустить и не зафиксировать.
Варьирование количественного признака — это отражение нормы реакции данного организма на условия среды. Количественно норма реакции может быть выражена в первом приближении пределами варьирования, а более точно — наиболее часто встречающейся величиной — модой и сигмой как мерой изменчивости. При обычном характере (Варьирования мода совпадает со средней арифметической из большого числа наблюдений.
Для характеристики размеров спор были произведены промеры длины и ширины аскоспор волжской, азербайджанской, северо-западной и сахалинской популяций, собранных весной 1965 г. и присланных нам соответствующими организациями, произведено измерение высоты и ширины перитециев из этих же географических мест. Измерены по длине и ширине конидии с листьев и конидии географических популяций, выращенных в чистой культуре на среде Чапека. Штаммы в момент измерений имели одинаковый возраст, поэтому они могли быть сравнимы между собой.
Изучая размеры аскоспор различных географических популяций, интересно отметить, что нижние крайние значения длины и ширины у всех популяций одинаковы, а именно, соответственно равны 12 и 6 мкм, причем крайние величины ширины аскоспор у трех популяций находятся в пределах б—7,5 мкм и лишь у одной немного выходят за эти рамки (Волжская — 6—9 мкм).
Наблюдая размеры аскоспор каждой популяции и размеры конидий с листьев и из чистой культуры, убеждаемся, что вариационная изменчивость ряда (а) у аскоспор очень невелика. Это и понятно, так как аскоспоры образуются путем редукционного деления и каждая клетка получает одинаковый гаплоидный набор хромосом.
При сравнительной оценке размеров аскоспоры — органа, наименее вариабельного, четырех географических популяций (северо-западной, волжской, азербайджанской и сахалинской) обнаружены достоверные различия в длине аскоспор этих популяций. При этом длина аскоспор у северо-западной, волжской и азербайджанской популяций сходна, но резко отличается от длины аскоспор сахалинской популяции (достоверность разности в среднем составляет 4,9, в то время как для первой степени вероятности безошибочного суждения для таких наук, как биология, медицина и т. п., достаточно значение td≥1,96), т. е. европейские популяции достоверно отличаются от сахалинской (азиатской). В свою очередь европейские популяции также представляют собой не однородное целое, а состоят из множества форм, имеющих различные морфологические и физиологические особенности.
Этот факт хорошо иллюстрируется на примере измерений конидий в чистой культуре (табл. 6). Все популяции достоверно различаются или по обоим признакам — длине и ширине, или по какому-либо одному из признаков, за исключением дальневосточной популяции, у которой размеры конидий одинаковы с северо-западной.