Предполагалось, что Эбиш приедет во Львов ко дню святой Агнешки — 21 января 1579 года, — когда в городе устраивалась традиционная ежегодная ярмарка. Однако этот приезд был отменен, и Острожская Библия вышла без гравюр немецкого мастера. Почему издатели Библии отказались от первоначального замысла — неизвестно. Высказывались предположения, что плата, запрошенная Эбишем, показалась им слишком высокой. Однако издание финансировал князь Острожский, а для него уплатить 700 золотых не представляло никаких затруднений. Более вероятно, что у издателей вызвала сомнение сама идея оформить Библию сюжетными гравюрами. Возможно, они решили, что такое нетрадиционное для русских книг оформление, к тому же выполненное мастером-немцем, сделает Библию похожей на лютеранскую, и решили не рисковать. Острожская Библия была оформлена традиционными орнаментальными гравюрами-заставками на дереве работы самого Ивана Федорова.

В период подготовки Библии в жизни Ивана Федорова произошла непонятная и неприятная история.

14 мая 1577 года знакомый первопечатника, известный краковский врач Мартин Сенник, автор книг «Испытание лекарств», «Гербарий, или Описание здешних, иностранных и заморских трав, какую силу они имеют, и как ими пользоваться», послал во Львов ремесленнику Власу Замочнику письмо, в котором сообщал, что Иван Федоров должен был оставить Власу Замочнику и Семену Седляру 600 золотых для пересылки в Краков автору письма. «Вероятно, — писал Мартин Сенник, — он знал, что я на святого Станислава (8 мая) теперь уже прошедшего, должен был принимать гостей, которые по его надобности приехали из немцев на ту ярмарку. А так как посланная мне сумма от пана Ивана не дошла, а гости сами по моей просьбе, и полагаясь на мое слово, приехали, должен был я за собственный счет их вознаградить и в том понес немалый убыток».

Иван Федоров и Семен Седляр были вызваны в суд.

Иван Федоров «под присягой, подняв два пальца к небу, публично признал и сказал, что он дал 50 золотых Сеньке Седляру с тем, чтобы тот передал их краковскому бумагоделательному мастеру Лаврентию через доверенного Мартина Сенника, однако по причине слухов о татарском набеге доселе не выслал их и сберегает у себя». О 600 золотых «он с удивлением узнал из прочитанного письма». Первопечатник показал также, что «ничего не знает про каких-то людей из Германии, которые должны были прибыть в Краков по его делу». Никаких купцов из Германии он не приглашал и денег Сеннику не обещал. То же показал Семен Седляр, сказав, что сам он Мартина Сенника никогда не встречал.

На этом дело и закончилось. Я. Д. Исаевич высказал предположение, что эта история как-то связана с переговорами Ивана Федорова с Эбишем. Однако кто был виноват в недоразумении, из-за которого почтенный краковский врач «понес немалый убыток» и, вероятно, навсегда рассорился с первопечатником — неизвестно.

В работе над Библией принимал участие и сын Ивана Федорова — Иван Друкаревич, как называли его по отцу, или Иван Переплетчик — по ремеслу, которое он к тому времени освоил. Иван Друкаревич женился на дочери львовского горожанина Татьяне Анципорковне и в 1580 году с молодой женой переехал к отцу в Острог. Вероятно, Иван Друкаревич, несмотря на молодость, был искусным мастером, поскольку ему первопечатник поручил переплетать Острожскую Библию.

Острожская Библия вышла в свет в августе 1581 года. Ее издание часто называют издательским подвигом Ивана Федорова.

Выход в свет первой полной славянской Библии был делом огромного общественного значения. E. Л. Немировский пишет: «Острожская Библия сыграла исключительно большую роль в истории культуры восточнославянских народов. В свое время она явилась для Запада своеобразным свидетельством идеологической и нравственной зрелости русских, украинцев и белорусов. Перевод Библии на национальный язык и издание ее на этом языке говорили о росте национального самосознания, укрепления позиций родного языка».

Острожская Библия представляет собой книгу большого формата, состоящую из 628 листов с текстом, размещенным в два столбца. На обороте титульного листа помещены герб князя Острожского и торжественные, по-старинному тяжеловесные вирши, сочиненные Герасимом Смотрицким. Восхваляя князя Острожского как инициатора издания Библии, Смотрицкий подчеркивает значение этого издания в деле сохранения национальной самобытности и борьбы против католической экспансии:

Затем следуют два предисловия: одно на двух языках — церковнославянском и греческом, написанное князем Острожским (или, по мнению некоторых исследователей, членами литературно-научного кружка от его имени), второе — Г. Смотрицким. Авторы предисловий благодарят Бога за благополучное завершение работы, рассказывают историю издания, еще раз подчеркивая общественно-политическое значение первой полной славянской Библии.

Завершается книга кратким послесловием Ивана Федорова с традиционной благодарностью Богу и указанием: «Сия богоприятная и богополезная книга Ветхого и Нового Завета напечатана мною многогрешным Иоанном Федоровым сыном из Москвы в богохранимом граде Остроге».

Судя по тому, что до нашего времени сохранилось около 350 экземпляров Острожской Библии, тираж ее был достаточно велик. Часть тиража князь Острожский отправил в Москву. Библия быстро распространилась по всей России. Владелец одного из экземпляров, живший, по его словам, «на севере, близ студеного моря-акиана, в земле Двинской», сделал на книге такую надпись: «Напечатано быша множество сих книг и привезены быша в Великия Россию, в царствующий град Москву и рассеяша во все грады».

Отпечатанная с присущим Ивану Федорову мастерством, Острожская Библия почиталась образцом типографского искусства не только современниками, но и знатоками книжного дела, жившими в более поздние времена. Так, известный украинский проповедник и полемист XVII века Михаил Андрелла-Оросвиговский писал, что «един листок» Острожской Библии он не отдал бы за всю Англию, Литву, Прагу и еще десяток различных стран и городов.

Острожская Библия получила широчайшее распространение по всему миру. Ее экземпляры разошлись по славянским странам: Болгарии, Сербии, Черногории, Польше. Острожская Библия привела в восхищение и Ивана Грозного, и он подарил ее экземпляр английскому послу Джону Горсею. Другой ее экземпляр оказался в библиотеке шведского короля Густава II Адольфа.

В настоящее время Острожская Библия является гордостью крупнейших книгохранилищ России, Украины, Польши, Германии, Англии, США…

Почти сто лет издание Ивана Федорова оставалось единственной Библией, напечатанной кириллицей. Следующая была выпущена по ее образцу в Москве в 1663 году.

Наряду с книгами Иван Федоров печатал и мелкую продукцию — различные брошюры и листовки. Сохранилась лишь одна такая листовка, отпечатанная в 1581 году, озаглавленная «Которого месяца што за старых веков дело короткое описание», или, как называют ее исследователи, «Хронология» — перечень названий двенадцати месяцев по-латыни, по-древнееврейски и «просто», то есть по-славянски, в сопровождении двустиший белорусского поэта Андрея Рымши, посвященных библейским событиям, происходившим в тот или иной месяц. Так, июнь («по геврейску сыбан, просто чырвец») — месяц, в который, согласно Библии, начался Великий потоп — представлен такими стихами: